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学术文章

王钢论文《辽宁中医杂志》肾炎灵对大鼠肾系膜

来源:未知 作者:njboda 时间:2014-10-30 20:20

文献出处:《辽宁中医杂志》  2005年第32 卷第9期

 

肾炎灵对大鼠肾系膜细胞增殖影响的实验研究

刘丽,  王钢,  倪斌

(江苏省中医院全国中医肾病三级实验室, 江苏 南京 210029 )

摘  要: 目的: 研究治疗慢性肾炎有效的中药复方肾炎灵对大鼠肾系膜细胞增殖的影响。方法: 取SD 大鼠肾脏进行肾系,膜细胞体外培养, 用肾炎灵浸青喂服系膜增生性肾炎大鼠, 将含药大鼠血清、模型组大鼠血清、正常大鼠血清加入到体外培养的大鼠系膜细胞中, 应用M竹法、流式细胞仪检测方法研究肾炎灵对系膜细胞的增殖和细胞周期的影响。结果: 喂服中药肾炎灵浸青大鼠的血清与正常组、模型组大鼠血清相比, 显著抑制体外培养系膜细胞的增殖, 且将系膜细胞增殖阻滞在G。~ G1期。结论: 肾炎灵临床治疗有效的机制可能与抑制肾系膜细胞增殖有关。

关键词: 肾炎灵; 系膜细胞; 增殖; 动物实验; 中药

中图分类号: R285.5   文献标识码: B   文章编号: 1000一1719(200 5)09一0969一03

    中药复方肾炎灵对慢性原发性肾小球疾病、难治性肾病综合征有确切的临床疗效, 且能明显降低患者的蛋白尿、红细胞尿, 改善肾小管间质和肾功能损害,明显降低患者的过氧化脂质、血浆和红细胞的超氧阴离子和SOD 活性阳1-3。本实验拟研究益肾清利中药复方肾炎灵对体外培养大鼠系膜细胞增殖和细胞周期的影响, 从细胞水平进一步深人探讨其作用机制。

1   材料与方法

1.1 材料

    动物: 远交系健康雄性SD大鼠5只, 体重150土21g,由南京中医药大学实验动物中心提供(实验动物使用许可证号SYXK<苏>2001一2010)。

    药物及主要试剂: 肾炎灵浸膏, 主要成分有雷公藤、蜀羊泉、生黄茂等, 由连云港康缘制药有限公司生产, 批号010215。每克浸膏干粉含生药9.4g, 成人日用量生药45g/60kg , 相当于肾炎灵片为4.8g/60kg。RP -MI l640 (GIBC0)、胎牛血清(FCS , Hyelone )、胶原酶lV型(Sigma )、M件(Sig ma )、胰蛋白酶(进口分装)、HEP-E S(B.M.)。

    主要仪器: 重庆XDS一1B 倒置生物显微镜, LDZS一2 离心机, DKB 一SA型电热恒温水槽, SW一CJ 一IF 净化工作台, Forma311IC 02培养箱, BI0 一RAD355O型酶标仪,FACsealibur 流式细胞仪。

1.2 方法

1.2.1 含药血清的制备       SD大鼠经适应性喂养1 周后, 随机分为正常组、模型组、肾炎灵浸膏低剂量组、中剂量组、高剂量组, 每组10只。参照文献4 制作系膜增生性肾炎大鼠模型, 肾炎灵浸膏治疗组自造模预免疫后开始给药, 根据文献5换算剂量, 肾炎灵低剂量组每只大鼠每日用药剂量0.15g/kg (合生药1.41g/kg);肾炎灵中剂量组每只大鼠每日用药剂量0.4g/kg(合生药4.14 g/kg );肾炎灵高剂量组每只大鼠每日用药剂量1.31g/kg(合生药12.31g/kg )。正常对照组灌服等量蒸馏水。全部大鼠于正式免疫8周后分别眼眶静脉丛取血, 所取大鼠血液经300Or/min 离心10min取血清, 56℃水浴30 min灭活, 0.22μm无菌滤器过滤除菌, 分装, --80℃保存备用。

1.2.2 细胞培养及鉴定      断头处死5只SD大鼠, 快速取出肾脏, 无菌Hanks 缓冲液洗涤肾脏, 剥去肾包膜, 剪刀剪取肾皮质成小碎块状, 经80目、150目、200目不锈钢网筛过滤分离肾小球,W 型胶原酶37℃水浴消化, 间隔振摇约15min,用不完全培养基离心洗涤后,完全培养基悬浮肾小球, 接种于塑料细胞培养瓶中, 镜下观察肾小球消化和密度情况,37℃、5% CO2 : 静止培养。细胞进行结蛋白、角蛋白免疫荧光鉴定。传代培养出大量细胞后进行下面实验。

1 .2. 3 含药大鼠血清对系膜细胞增殖抑制的影响      参照文献6, 0.25 % 胰酶消化大鼠系膜细胞, 调细胞密度为约lx105 )个/ m L , 接种于96孔培养板上, 每孔200μL ,37℃ 、5%CO2培养4 8 h 后系膜细胞完全贴壁,弃培养液, 分别加人不同浓度(2.5 % 、5 %、10 % ) 正常大鼠血清、模型组血清及肾炎灵高、中、低剂量组血清,并用Fcs分别补足血清浓度至20 % , 培养24、48 h。每组培养结束前4h 加人MTT (5 g/L)20uL/孔, 结束培养时弃上清, 加入DMS0 150μL/孔, 振荡l0 min , 酶标仪上测定OD490值。统计学方法采用SPSS1O.O软件,One 一Way ANOVA 方法分析。

1.2. 4 含药大鼠血清对系膜细胞周期的影响      0.25 %胰酶消化系膜细胞, 调细胞密度为约lxl05个/ m L , 接种于细胞培养瓶中, 预培养48 h 待系膜细胞完全贴壁后, 弃旧培养基, 将细胞分成3 组: (1 )10% 正常大鼠血清; (2 ) 10 % 模型组血清; (3 )10 % 肾炎灵中剂量组血清。每组分别用FCS 补足血清浓度至20 %,37 ℃ 、5 %CO2 分别培养24、48 h。每组设3个平行实验。培养结束后, 消化培养瓶内细胞, I000 r/min 离心5min, 弃上清液。PBS工作液洗涤细胞2次, 调细胞密度为约lx106/ m L,将细胞悬浮于PI 低渗液中, 置4 ℃染色20min , 过滤, 流式细胞仪检测细胞周期。统计采用t检验。增殖指数7(PI) =(S+G2/M )( G0/Gl+S+G2/M ) ×100%。

2   实验结果

2.1  细胞增殖检测     处理24h:2.5%含药血清处理时,肾炎灵高剂量组与正常组、模型组有极显著差异(P< O.0l )。5.0%含药血清处验理时, 肾炎灵高、中剂量组与正常组有显著差异(P < 0.01 )。10.0%含药血清处理时,肾炎灵高、中剂量组与正常组有极显著差异(P<0.05、P<0.01),肾炎灵高、中剂量组与模型组有显著差异(P< 0.01 ),肾炎灵低剂量组与模型组有显著差异(P<0.05),模型组与正常组有显著差异(P<0.05),见表1。处理48h:2.5%含药血清处理时,肾炎灵高剂量组与模型组有显著差异(P<0.05。5%含药血清处理时,肾炎灵高、中剂量组与正常组、模型组皆有极显著差量组与模型组皆有极显著性差异(P< 0.01 )。10.0% 含药血清处理时, 肾炎灵高剂量组与正常组有极显著差异(P< 0.01 );肾炎灵高、中、低剂量组与模型组皆有极显著性差异(P< 0.01 ),见表2。

表1 大鼠肾系膜细胞培养24OD490 ( X- 士 S )

浓度

正常组

模型组

高剂量组

中剂量组

低剂量组

2.5%

0.224±

0.008

0.218±

0.006

0.193±

0.010

0.207±

0.009

0.217±

0.004

5.0%

0.165±

0.007

0.153±

0.004

0.144±

0.004**

0.147±

0.001**

0.165±

0.010

10%

0.217±

0.010

0.248±

0.005*

0.161±

0.145△△

0.221±

0.026**△△

0.217±

0.019

注: 与正常组比较, * P <0.05, **P<0.01; 与模型组比较,P< 0.05, △△P<0.01 。 

表2 大鼠肾系膜细胞培养48OD490 ( X- 士 S )

浓度

正常组

模型组

高剂量组

中剂量组

低剂量组

2.5%

0.231±

0.035

0.251±

0.014

0.220±

0.012

0.238±

0.034

0.230±

0.021

5.0%

0.244±

0.011

0.249±

0.015

0.192±

0.006**△△

0.201±

0.024**△△

0.230±

0.013

10%

0.223±

0.025

0.242±

0.004

0.193±

0.009**△△

0.202±

0.022△△

0.207±

0.009△△

注: 与正常组比较, * P <0.05, **P<0.01; 与模型组比较,P< 0.05, △△P<0.01 。 

2.2 倒置显微镜观察     含肾炎灵药物血清作用细胞后, 系膜细胞收缩明显, 间距增大, 胞质中颗粒物增多, 透明度降低, 有部分细胞悬浮, 随时间延长漂浮细胞形态始终为梭形或星形等。对照组细胞生长状态良好, 透明度高,细胞形态始终为梭形或星形等。

2.3 肾炎灵浸膏对大鼠系膜细胞周期的影响       从表3、表4 可知, 处理细胞24h、48h, 肾炎灵组PI 与模型组比较皆有极显著差异(P< 0.01 ) , 处理细胞24h 模型组PI 与正常组比较有显著差异(P< 0.05 ) , 处理细胞48h , 模型肾炎灵组与正常组比较有显著差异(P< 0. 05 ) , 模型组与正常组相比有显著差异。由此可看出, 经肾炎灵药物处理后, 大量系膜细胞被阻滞在G0一G1成分, 抑制了细胞有丝分裂, 抑制了细胞增殖。

3   讨   论

    大量研究表明, 系膜细胞是肾小球疾病中扮演重要角色的肾小球固有细胞之一, 以炎症为主的肾小球疾病早期均伴有明显的系膜细胞增殖。系膜细胞的增殖和细胞外基质的积聚是导致肾小球疾病进一步恶化的主要因素。抑制系膜细胞的增殖则可减缓肾小球硬化和肾间质纤维化。中药复方肾炎灵清补结合, 为脾肾双补、清利兼施之剂。

    本实验结果表明, 10%大鼠血清作用24 h 后, 模型组与正常组相比有显著差异, 说明模型组血清能促进系膜细胞增殖, 模型组血清中含有一些促细胞增殖的成分, 体现了一定的“ 病理” 效应。而同时, 肾炎灵高、中、低剂量组与模型组均表现为显著性差异, 表明肾炎灵能抑制病理状态下的系膜细胞增殖。但是模型组血清对系膜细胞的促增殖作用并不表现为时问效应,因为当10% 含药血清处理48 h 后, 模型组虽然均值比正常组高, 但差异并不显著, 说明模型组血清内促增殖因子“ 有效” 作用时间具有一定的局限性。无论模型组血清与正常组血清对细胞促增殖的作用差异是否显著, 肾炎灵高、中、低剂量组血清都表现了对细胞增殖的抑制作用, 且随着剂量组由高到低、浓度由大到小依次表现为抑制细胞增殖, 体现了一定的浓度效应。

    细胞周期是指细胞从上一次细胞分裂结束到下一次分裂终了的过程。细胞周期由Gl 期、S 期、G2期和M 期组成。G1期、S 期和G2期为合成间期,M 期即分裂期。Go期细胞是指细胞分裂后相对稳定的细胞, 在适宜的刺激下, 细胞能被触发, 从静止状态进人增殖状态。细胞周期中有2个决定性阶段: 第一个决定性阶段是从Gl 过渡到S 期, 此时DNA 开始复制; 另一个决定性阶段是从G2过渡到M 期, 此时染色体浓缩,有丝分裂开始。本实验结果体现为在含药血清作用后, 系膜细胞被阻滞于G0一G1期, 从而在一定程度上抑制了细胞有丝分裂的发生, 表明中药复方肾炎灵抑制细胞增殖的细胞周期决定性阶段是G0 一G1 期。

    肾炎灵高、中、低剂量组血清均由造模动物喂服中药后而获得, 这与一般的从喂服中药的正常大鼠中获取血清不同, 它是病理状态下治疗疾病后的血清,其既内含中药有效成分又可能内含疾病状态下机体代谢的有效成分, 因此用造模后喂服中药的血清做实验更能反映药物的治疗机理。以上实验结果表明肾炎灵治疗肾小球疾病的有效作用机理与其对肾系膜细胞的增殖有显著抑制作用有关, 且将细胞增殖阻滞于G0 一Gl期。



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